UDOSTĘPNIJ ARTYKUŁ Z GRAFIKĄ:

Opis badania

"Koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej typu 2 (SARS-CoV-2) powoduje ciężki zespół ostrej niewydolności oddechowej. Szczepionki mRNA skierowane przeciwko białku wypustkowemu SARS-CoV-2 spowodowały rozwój Abs (przeciwciał) i ochronnej odporności. Aby określić mechanizm, przeanalizowaliśmy kinetykę indukcji krążących egzosomów białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 i Ab po szczepieniu zdrowych osób. Wyniki wykazały indukcję krążących egzosomów zawierających białko wypustek w dniu 14 po szczepieniu, a następnie Abs 14 d po drugiej dawce. Egzosomy z białkiem wypustek, Abs przeciwko białku S SARS-CoV-2, a limfocyty T wydzielające IFN-γ i TNF-α wzrosły po dawce przypominającej. Transmisyjna mikroskopia elektronowa egzosomów również wykazała na ich powierzchni białko szczytowe Ags. Egzomy z białkiem kolczastym i Abs zmniejszyły się równolegle po czterech miesiącach. Wyniki te pokazują ważną rolę krążących egzosomów z białkiem wypustkowym w skutecznej immunizacji po szczepieniu opartym na mRNA. Jest to dalej udokumentowane przez indukcję humoralnych i komórkowych odpowiedzi immunologicznych u myszy immunizowanych egzosomami niosącymi białko wypustek.

Wstęp

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) jest wywoływana przez koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Większość zarażonych osób z łagodnymi objawami samoistnie powraca do zdrowia, ale zakażenie SARS-CoV-2 może skutkować ciężką ostrą chorobą układu oddechowego wymagającą wentylacji mechanicznej ze śmiertelnością około 1%. Aby wywołać odporność i zmniejszyć nasilenie zakażenia SARS-CoV-2, opracowano kilka kategorii szczepionek (1, 2). Według ostatnich aktualizacji Centrum Kontroli i Prewencji Chorób śmiertelność u pacjentów z SARS-CoV-2 jest czterokrotnie wyższa u osób w wieku 30-39 lat w porównaniu z osobami w wieku 18-29 lat i 600 razy wyższa u osób w wieku 85 lat I starszy. (Źródło: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/investigations-discovery/hospitalization-death-by-age.html)

Szczepionki oparte na mRNA przeciwko infekcji wirusem SARS-CoV-2 opracowane przez firmy Pfizer-BioNTech i Moderna uzyskały autoryzację do stosowania w sytuacjach awaryjnych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (3-5). Szczepionki te chronią biorców przed infekcją SARS-CoV-2 poprzez rozwój humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Korzystny efekt szczepienia jest często określany przez pomiar odpowiedzi Ab na białko wypustek (6). W obecnym badaniu przeanalizowaliśmy osiem zdrowych osób dorosłych, które otrzymały obie dawki szczepionki SARS-CoV-2 (Pfizer-BioNTech). Nasze wyniki wykazały indukcję krążących egzosomów niosących białko wypustek SARS-CoV-2 do 14 dnia, kiedy Abs białka wypustek nie były wykrywalne w surowicach przy użyciu metody ELISA opracowanej w naszym laboratorium. Krążące Ab były wykrywalne dopiero po drugiej dawce przypominającej szczepionki (dni 14), a ilość egzosomów zawierających białko wypustek wzrosła maksymalnie ~12-krotnie. Wyniki te silnie potwierdzają ważną rolę indukcji egzosomów w odpowiedzi immunologicznej po immunizacji. Jest to dodatkowo wspierane przez nasze odkrycie, że immunizacja myszy egzosomami od zaszczepionego osobnika białkiem wypustek SARS-CoV-2 spowodowała rozwój Abs specyficznego dla białka wypustek SARS-CoV-2.

Materiały i metody

Kohorta pacjentów i dane demograficzne

Przeanalizowaliśmy ośmiu zdrowych dorosłych ochotników zaszczepionych szczepionką opartą na mRNA SARS-CoV-2 (Pfizer-BioNTech). Krew pobierano przed szczepieniem, 7 i 14 dni po pierwszej dawce, 14 dni po drugiej dawce i 4 miesiące po obu dawkach. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Boards (IRB) w szpitalu św. Józefa (numer IRB PHXB16-0027-10-18).

Izolacja egzosomów i analiza śledzenia nanocząstek

Egzosomy wyizolowano z 500 µl osocza przy użyciu zestawu Invitrogen Exosome Isolation Kit, a następnie poddano filtracji 0,22 mikrona (7). Wszystkie egzosomy analizowano pod kątem wielkości za pomocą NanoSight NS300 (Malvern Panalytical, Great Malvern, Wielka Brytania), a średni rozmiar cząstek użytych w naszych eksperymentach wynosił <200 nm (8).

Wykrywanie Abs do białka kolczastego SARS-CoV-2 i białka nukleokapsydu z próbek ludzkiego osocza

Rozwój Abs do SARS-CoV-2 spike Ag określono za pomocą testu ELISA opracowanego w naszym laboratorium. W skrócie, 1 μg/ml białka wypustkowego SARS-CoV-2 (Sino Biological) zawieszonego w PBS powlekano na płytce ELISA i inkubowano przez noc w 4°C. Do tych płytek dodano ludzkie osocze w rozcieńczeniu 1:750. Detekcję przeprowadzono przy użyciu drugorzędowej antyludzkiej IgG-HRP (1:10 000) i wywołano przy użyciu substratu tetrametylobenzydyny i odczytano przy 450 nm. Jako kontrole pozytywne zastosowano próbki osocza od osób zakażonych SARS-CoV-2 (n = 10) i osób zdrowych immunizowanych obiema dawkami szczepionki (n = 20). Zdrowe osoby bez historii infekcji SARS-CoV-2 i bez szczepień przeciwko SARS-CoV-2 zastosowano jako kontrole negatywne (n = 20). Stężenie Ab obliczono stosując krzywą standardową ze znanych stężeń odpowiednich Abs (Thermo Fisher Scientific).

Charakterystyka egzosomów za pomocą Western blot

Całkowite białko egzosomu (15 µg) rozdzielono przez PAGE i białka przeniesiono na błonę z difluorku winylidenu. Western blot przeprowadzono jak opisano w (9). Intensywność prążka białka docelowego oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ, a wszystkie bloty znormalizowano za pomocą CD9.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa izolowanych egzosomów dla białka szczytowego SARS-CoV-2

Egzomy znakowano immunozłotem i mysim Ab wypustkowym anty-SARS-CoV-2, a do siatek dodawano Ab koronawirusa FIPV3-70 (1:100). Siatki przemywano i barwiono octanem uranylu i oglądano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (JEOL USA, Peabody, MA) (10).

ELISPOT dla odpowiedzi ludzkich limfocytów T na białko szczytowe SARS-CoV-2 Ag

Krew pobrano od osób po uzyskaniu świadomej zgody, a badanie zostało zatwierdzone przez IRB (numer IRB PHXB16-0027-10-18). PBMC wyizolowano metodą rozdzielania gradientowego Ficoll-isopaque (ICN Biomedicals, Aurora, OH) i zamrożono. Później te PBMC przetworzono do testu ELISPOT, jak opisano w poprzednich publikacjach (9, 10).

Immunizacja myszy egzosomami SARS-CoV-2 Ag

Myszy C57BL/6 immunizowano s.c. z egzosomami izolowanymi od zaszczepionych osobników z pozytywnym wynikiem białka wypustkowego SARS-CoV-2 (egzosomy od 14 dnia po 2 dawce szczepionki). Trzy grupy zwierząt immunizowano bez żadnych adiuwantów 100 μg w dniach 1, 7 i 21: 1) grupa kontrolna zwierząt (n = 5), 2) egzosomy izolowane od jednego zdrowego osobnika po szczepieniu (n = 5), 3 ) egzosomy izolowane od drugiego zdrowego osobnika po szczepieniu (n = 5) i 4) myszy immunizowanych białkiem wypustek SARS-CoV-2 (n = 5). Zwierzęta uśmiercono w dniu 30, pobrano krew do testu ELISA i pobrano śledziony w celu uzyskania odpowiedzi komórek T.

Wykrywanie Abs do białka szczytowego SARS-CoV-2 w surowicy myszy

Rozwój Ab do SARS-CoV-2 spike Ag określono przy użyciu testu ELISA, jak opisano w poprzedniej sekcji.

ELISPOT dla odpowiedzi mysich splenocytów na białko wypustek SARS-CoV-2 Ags

Śledziony myszy zebrano 30 dnia po immunizacji, a splenocyty wyizolowano przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Hypaque i analizowano za pomocą ELISPOT, jak opisano wcześniej (9, 10).

Analiza statystyczna

Dane analizowano przy użyciu oprogramowania Prism 8.0 (GraphPad). Poziomy Ab dla białka wypustek SARS-CoV-2 i OD egzosomów zawierających białko wypustek SARS-CoV-2 porównano za pomocą testu rang Wilcoxona. Wyniki z doświadczeń na zwierzętach analizowano za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA. Dane wyrażono jako średnią i SD. Za istotne statystycznie uznano wartości p < 0,05.

Wyniki i dyskusja

Izolacja egzosomów

Średnia wielkość cząstek użytych w naszym badaniu wynosiła <200 nm, zgodnie z wielkością egzosomu opisaną przez Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Pozakomórkowych. Reprezentatywne obrazy dla egzosomów podano na (ryc. 1A. Nie było znaczącej różnicy w liczbie egzosomów od różnych osobników.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała ekspresję powierzchniową białka wypustkowego SARS-CoV-2 w izolowanych egzosomach od osób zaszczepionych.

Przeprowadziliśmy transmisyjną mikroskopię elektronową przy użyciu Abs swoistych dla piku SARS-CoV-2, aby wykazać obecność SARS-CoV-2 Ags na powierzchni egzosomów od osób kontrolnych i zdrowych zaszczepionych osób. Egzosomy od zaszczepionych osób są pozytywne pod względem SARS-CoV-2 Ag (ryc. 1B). Wybarwiliśmy również obie próbki egzosomów koronawirusem FIPV3-70 Ab jako kontrolą negatywną i nie zaobserwowaliśmy żadnej pozytywnej reakcji w egzosomach (ryc. 1B).

Kinetyka rozwoju Abs dla białka szczytowego SARS-CoV-2 u osób zaszczepionych

U wszystkich zdrowych osób zaszczepionych po 14 dniu drugiej dawki szczepionki (średnie stężenie 2401,25 ± 773,45 ng/ml) wykryto przeciwciała przeciwko białku wypustkowemu SARS-CoV-2 z wartościami p <0,0001 w porównaniu z brakiem szczepienia i dniem 14 pierwszej dawki szczepionki. Poziomy Ab po 4 miesiącach szczepienia spadły do ​​1107,38 ± 681,63 ng/ml. Spadek ten jest znacznie niższy w porównaniu z Abs rozwiniętymi 14 dnia po drugim podaniu szczepionki (p = 0,0313) (ryc. 2A).

Krążące egzosomy izolowane od zaszczepionych osób zawierały białko wypustek SARS-CoV-2 Ag S2

Przeanalizowaliśmy osocze od zaszczepionych zdrowych osób w 0, 7 i 14 dniu po pierwszej dawce szczepionki i 14 dniu drugiej dawki pod kątem obecności egzosomów niosących białko wypustek SARS-CoV-2 (ryc. 2B, 2C). Wyniki wykazały obecność wypustek SARS-CoV-2 Ag S2 na egzosomach w 14. dniu dawki 1. W 14. dniu dawki 2 nastąpił istotny wzrost stężenia białka wypustek, przy wartości p 0,0299. Ilość białka S SARS-CoV-2 w egzosomach po 4 miesiącach obu dawek szczepionki była istotnie zmniejszona w porównaniu z 14 dniem po drugiej dawce, z wartością p 0,0078. Kinetykę rozwoju Ab do białka wypustek i egzosomów z białkiem wypustek dla każdego zdrowego osobnika w różnych punktach czasowych (dzień 14 po pierwszej i drugiej dawce oraz 4 miesiące po drugiej dawce) pokazano na (ryc. 2D. Obie kinetyki rozwoju Ab a ilość egzosomów białka szczytowego SARS-CoV-2 jest ze sobą zgodna, ponieważ obydwa są zwiększone po drugiej dawce przypominającej w dniu 14 (ryc. 2E).Istnieje spadek poziomów Ab w stosunku do SARS-CoV- 2 białko wypustek i ilość białka wypustek SARS-CoV-2 w egzosomach u każdego zdrowego osobnika od 14 dnia drugiej dawki przypominającej do 4 miesięcy drugiej dawki przypominającej (ryc. 2D, 2E).Dane dla każdego osobnika dla tego podzbioru są podane jako Ryc. Uzupełniający 1 i Ryc. Uzupełniający 2.

Krążące egzosomy izolowane od zaszczepionych zdrowych osób zawierały białko wypustkowe SARS-CoV-2 Ag S2

Przeanalizowaliśmy egzosomy od zaszczepionych zdrowych osób w 14 dniu po drugiej dawce szczepionki. Wyniki wykazały znaczny wzrost stężenia egzosomów z białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 (ryc. 2F, 2G). Równolegle stwierdziliśmy również znacznie podwyższony poziom Abs wobec białka szczytowego SARS-CoV-2 u osób po podaniu obu dawek szczepionki w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (ryc. 2H).

Wyższe poziomy cytokin IFN-γ i TNF-α u zdrowych zaszczepionych osób w porównaniu z grupą kontrolną (IFN-γ i TNF-α są mediatorami procesu zapalenia o działaniu prozapalnym - przyp.red.)

Odpowiedzi komórek T na białko szczytowe SARS-CoV-2 Ag u zdrowych, zaszczepionych osób analizowano za pomocą ELISPOT. Cytokiny komórki produkujące IFN-γ i TNF-α były znacząco wyższe u zaszczepionych zdrowych osób w porównaniu ze zdrowymi kontrolami w odpowiedzi na SARS-CoV-2 spike Ag (p = 0,0078) (ryc. 2I). Limfocyty T wytwarzające którąkolwiek z cytokin w odpowiedzi na nukleokapsyd Ag nie były zwiększone.

Immunizacja egzosomami od zaszczepionego osobnika białkiem wypustek indukowała wyższy poziom Abs wobec białka wypustek SARS-CoV-2 u myszy

Myszy C57BL/6 immunizowaliśmy egzosomami izolowanymi od w pełni zaszczepionych osobników i kontroli. Jednak myszy immunizowane egzosomami od w pełni zaszczepionych osobników rozwinęły znacząco wyższe Abs wobec SARS-CoV-2 spike Ag w dniu 15 niż w grupie kontrolnej (181,49 ± 37,02 w porównaniu z 64,44 ± 1,7; p < 0,0449) w dniu 21 (352,82 ± 128,82 w porównaniu z 20,84 ± 2,24; p < 0,0001 oraz w dniu 30 (372,34 ± 56,08 vs 25,17 ± 1,08 p < 0,0001) (ryc. 3A). Zwierzęta C57BL/6 immunizowane białkiem wypustek SARS-CoV-2 również wykazały zwiększone poziomy Ab wypustek SARS-CoV-2 (Fig. 3A).

Wyższe poziomy cytokin (IFN-γ i TNF-α) w limfocytach śledziony myszy immunizowanych egzosomami od osób zaszczepionych

Limfocyty śledziony od myszy immunizowanych egzosomami od osób zaszczepionych w porównaniu z kontrolą wykazały wzrost liczby komórek wydzielających cytokiny: IFN-γ (853,77 ± 517,84 w porównaniu z 340,36 ± 38,78) i TNF-α (568,25 ± 327,72 w porównaniu z 102,14 ± 19,06). miejsc na milion, ale różnice nie są istotne statystycznie. Podobne wyniki zaobserwowano u myszy immunizowanych białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 (Fig. 3B). Grupa myszy immunizowanych białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 również wykazała podwyższone poziomy IFN-γ i TNF-α (ryc. 3B). W obecnym badaniu osobom podawano szczepionkę opartą na mRNA opracowaną przez firmę Pfizer-BioNTech, a nasze wyniki wyraźnie pokazują, że do 14 dnia po podaniu pierwszej dawki szczepionkowych egzosomów przenoszących białko wypustek do SARS-CoV-2 doszło do indukcji, a następnie szczytowa odpowiedź przeciwciał swoistych dla białka rozwijająca się do 14 dnia po immunizacji przypominającej. Cztery miesiące po szczepieniu poziomy Ab w osoczu spadły. Ten sam trend zaobserwowano dla krążących egzosomów z białkiem kolczastym. Wyniki te potwierdzają wniosek, że indukcja krążących egzosomów białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 jest potencjalnie obowiązkowa dla skutecznej immunizacji w wyniku podania szczepionki opartej na mRNA. Postulujemy, że te egzosomy z białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 są wychwytywane przez APC, co powoduje aktywację immunologiczną. Potencjał immunogenny egzosomów w infekcjach wirusowych dróg oddechowych został już opisany przez nas i innych (11-13).

Zaszczepiliśmy również zwierzęta C57BL/6 krążącymi egzosomami niosącymi białko wypustek wyizolowane od zaszczepionych osobników i wykazaliśmy, że te egzosomy są immunogenne. Po immunizacji zwierzęta te rozwinęły zarówno przeciwciała przeciw białku wypustek SARS-CoV-2, jak i komórkowe odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla białka wypustek SARS-CoV-2. Nasze wcześniejsze odkrycia wykazały, że immunizacja myszy ludzkimi egzosomami niosącymi autoantygeny płuc skutkowała powstaniem Abs przeciwko autoantygenom płuc. Nastąpiło to po związaniu ludzkich egzosomów z mysimi APC, prowadząc do odpowiedzi immunologicznych u myszy. Dlatego proponujemy, że mechanizm, dzięki któremu odpowiedzi immunologiczne rozwinęły się po immunizacji myszy, wymaga wiązania egzosomów z mysimi APC, co prowadzi do rozwoju zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej na białko wypustek. Interesujące jest również to, że taka strategia immunizacji skutkowała zwiększoną częstością limfocytów śledziony wydzielających IFN-y i TNF-a po stymulacji antygenowej (zwiększoną ilością cytokin prozapalnych - przyp.red.). Opierając się na tych wynikach w modelach mysich, postulujemy, że szczepienie zdrowych osobników oparte na mRNA będzie skutkowało nie tylko odpowiedziami Ab, ale także odpornością komórkową.

Podsumowując, egzosomy przenoszące białko wypustek do SARS-CoV-2 są indukowane i są wykrywalne 14 dnia po pierwszej dawce szczepienia (wykrywane tez były 4 miesiące po przyjęciu 2.dawki - j.w. - przyp.red.), a Abs specyficzne dla białka wypustek SARS-CoV-2 były wykrywalne na późniejszym etapie po podaniu dawki przypominającej. Proponujemy, że indukcja krążących egzosomów białkiem wypustkowym SARS-CoV-2 Ag jest niezbędna do skutecznej immunizacji po szczepieniu zdrowych osób w oparciu o mRNA. Wykazaliśmy również, że egzosomy od zaszczepionych osób były immunogenne i indukowały Abs na białko wypustek SARS-CoV-2, a także odpowiedzi limfocytów T na białko wypustek Ag, co sugeruje, że egzosomy oparte na mRNA indukowane przez szczepienia z białkiem wypustek SARS-CoV-2 Ag nie tylko indukuje odporność humoralną, ale także komórkowe odpowiedzi immunologiczne."

Komentarz redakcji:

na podstawie powyższego badania stwierdzono obecność krążących w organizmie człowieka egzosomów zawierających toksyczne białko S - w 14 dniu po przyjęciu 1.dawki, w jeszcze większej ilości w 14 dniu po przyjęciu 2.dawki, a także obserwowano jego obecność w 4 miesiące później.

Biorąc pod uwagę udowodnioną szkodliwość białka S:

"BIAŁKO S KORONAWIRUSA ODGRYWA DODATKOWĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W CHOROBIE

Naukowcy i współpracownicy Salka pokazują, w jaki sposób białko uszkadza komórki, potwierdzając, że COVID-19 jest głównie chorobą naczyniową."

https://www.salk.edu/news-release/the-novel-coronavirus-spike-protein-plays-additional-key-role-in-illness/

"Uważaj na białko szczytowe SARS-CoV-2: jest więcej niż na pierwszy rzut oka."

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC7365923/

"Białko kolce SARS-CoV-2 zmienia funkcję bariery w statycznych i 3D mikroprzepływowych modelach in vitro bariery krew-mózg człowieka"

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33053430/

"Choroba koronawirusowa 2019 i udar mózgu: objawy kliniczne i spostrzeżenia patofizjologiczne."

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32689643/

"Białko S1 SARS-CoV-2 przekracza barierę krew-mózg u myszy."

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33328624/

"SARS-CoV-2 infekuje splot naczyniówkowy mózgu i zaburza barierę krew-CSF w organoidach ludzkiego mózgu."

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33113348/

"Związane z dawką nieprawidłowe hamowanie wewnątrzkomórkowej ekspresji perforyny przez podjednostkę S1 glikoproteiny wypustkowej, która zawiera domenę wiążącą receptor z SARS-CoV-2."

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34203929/

"Sygnalizacja komórkowa za pośrednictwem białek szczytowych SARS-CoV-2 w komórkach naczyń płucnych."

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33232769/

jakie konsekwencje będzie miała tak długotrwała obecność białka S w organizmie człowieka?

Biorąc pod uwagę zaobserwowany znaczący wzrost ilości prozapalnych cytokin IFN-γ i TNF-α u zaszczepionych zdrowych osób oraz fakt, że są to cytokiny, które biorą udział w patogenezie burzy cytokinowej obserwowanej w cięższych przypadkach COVID 19, należy zastanowić się nad możliwymi konsekwencjami celowo wyindukowanego ogólnoustrojowego stanu zapalnego.

Powyższe badanie wyraźnie zaprzecza wcześniejszym informacjom, jakoby białko S miało być produkowane po przyjęciu preparatu mRNA lokalnie i wzbudzać odpowiedź immunologiczną, chociaż takie teorie propagował m.in. dr hab. Piotr Rzymski, biolog medyczny z Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, w kwietniu 2021 roku:

"W praktyce, wyprodukowane przez nieliczną populację komórek białko S jest prezentowane na ich powierzchni w celu szkolenia układu odporności pod względem produkcji swoistych przeciwciał i odpowiedzi komórkowej. Ostatecznie, komórki prezentujące białko S zostają usunięte przez komórki układu immunologicznego. Procesy te mają charakter krótkotrwały i lokalny, a nie systemowy." - twierdził w/w biolog.

opracowała: lek. Ewelina Gierszewska